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酶不是标记在抗体上，而是首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的敏感性。

(一)酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体(第二抗体)，将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。

(二)PAP法：PAP法是在酶桥法基础上的改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体(抗酶抗体)与酶组成可溶性复合物(PAP复合物)。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体(第二抗体)，将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。

(三)双桥PAP法：在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未充分饱和Fc段结合，或桥抗体与特异性第一抗体尚未饱和的Fc段结合。

(四)碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP法)

辣根过氧化物酶(HRP)是免疫组化的首选用酶，但有些组织细胞含内源性过氧化物酶限制了HRP的广泛应用，尽管用甲醇过氧化氢进行处理可以抑制内源性过氧化物酶活性，但同时也会影响抗原的显示。

APAAP法就是用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酸酶(AAP)法，即简称APAAP。